EXPOSÉ DES SCIENTIFIQUES

Laboratoire de Génétique Moléculaire et Chromosomique du PROFESSEUR Mireille CLAUSTRES.
Laboratoire du Docteur Christian HAMEL, Inserm.583 Physiopathologie et thérapie des déficits sensoriels.

* Mademoiselle Anne VIELLE : " Le syndrome de USHER "

* Madame Valérie FAUGERE : " Les Rétinites pigmentaires "

Le financement reçu de l'association SOS Rétinite a permis de développer un pôle de recherche appliquée sur 2 pathologies génétiques :

- Les rétinites pigmentaires

- Le syndrome de USHER

Le but du travail effectué au laboratoire est de mettre en évidence une relation entre l'apparition des symptômes cliniques liés à une maladie et la présence d'une mutation au niveau d'un des gènes impliqués dans la pathologie.
Il faut savoir que notre corps est constitué de cellules et que chaque cellule contient du matériel génétique, l'ADN différencié en 46 chromosomes. Un gène est une partie d'ADN localisé à un endroit précis sur un chromosome. Un gène code pour une protéine entrant dans une fonction bien précise comme la vue, l'audition, la couleur des yeux...
Si le gène porte une variation anormale, la protéine synthétisée est non fonctionnelle et entraîne une pathologie. On peut comparer la variation au niveau des gènes à une faute d'orthographe au niveau d'une phrase qui fait qu'on ne comprendrait pas correctement le message.
Certaines fonctions sont liées à un seul gène alors que d'autres peuvent dépendre de plusieurs gènes localisés à des endroits différents. Il est ainsi possible que chez 2 patients souffrant de la même pathologie, le gène responsable ne soit pas le même. C'est le cas des 2 pathologies étudiées grâce aux bourses de SOS Rétinite.

1- Rétinite pigmentaire

Pour l'ensemble des rétinites pigmentaires, plus de 30 gènes sont susceptibles d'être impliqués. Afin d'effectuer un travail plus efficace, il a été décidé de focaliser notre recherche plus particulièrement sur un des gènes concernés.
En fonction des variations déjà décrites, notre travail consiste à utiliser les techniques appropriées dans l'identification de telles variations. Des prélèvements de patients et apparentés nous sont envoyés de différents endroits de France, voire de l'étranger.

2- Syndrome de USHER

Il se caractérise par une RP associée à une surdité.
En fonction de la gravité des symptômes, on peut distinguer 3 types cliniques, les types 1, 2 et 3. Les types 1 et 2 représentent 90% des cas de USHER.
Les recherches au laboratoire ont débuté il y a 2 ans et demi.
A l'heure actuelle nous gérons un pool de 105 familles totalisant 130 patients, dont 47 de type 1, 56 de type 2 et 2 de type 3.

Notre recrutement est national et international et nous sommes le seul laboratoire en France à faire de la recherche appliquée sur le syndrome de USHER.

Comme pour les RP, plusieurs gènes sont impliqués dans cette pathologie, ce qui rend l'étude plus fastidieuse puisqu'il est bien sûr important d'étudier le bon gène impliqué dans la famille.
Comme pour toute pathologie, la détection des anomalies au niveau du gène en cause se fait grâce à des techniques appropriées. De plus les gènes impliqués dans le syndrome de USHER sont pour la plupart des gènes de taille importante qui sont longs à étudier.

En résumé:

Pour chaque pathologie, la stratégie est sensiblement la même :

• recherche du gène responsable dans la famille quand plusieurs gènes sont impliqués dans la pathologie ;
• recherche da l'anomalie au niveau du gène ;
• identification de l'anomalie ;
• analyse des conséquences sur la protéine et ses fonctions ;
• information des résultats au patient.

En fonction des pathologies et de la complexité, les recherches peuvent être longues et durer parfois des années. De plus, les techniques et les données de la Biologie Moléculaire évoluent continuellement et demandent parfois de revenir sur certains dossiers qui n'auraient pas été résolus.
Il est à noter que notre recrutement est en augmentation. Les données que nous accumulons vont être stockées dans une base de données que nous mettons en place au sein du laboratoire, consultable sur internet. Elle va permettre de répertorier les anomalies mises en évidence tant au sein de notre laboratoire qu'au niveau de tous les laboratoires dans le monde. Ceci permettra de partager les données entre les différents centres. Il en résultera une meilleure connaissance des différentes interactions impliquées au sein d'une fonction.

Mieux connaître les causes génétiques d'une maladie c'est assurer une meilleure prise en charge dans un cadre de thérapie génique.

52) Laboratoire du DOCTEUR Christian HAMEL (INSERM 583)

* Mademoiselle Cécilia MAUBARET : " Identification de nouveaux gènes responsables des rétinopathies pigmentaires".

La rétinite pigmentaire (RP) est une maladie génétique conduisant à la dégénérescence des photorécepteurs. Elle se caractérise par la présence au fond d'œil de dépôts pigmentaires, une pâleur papillaire et la diminution du calibre des vaisseaux rétiniens. Cette maladie se manifeste chez le patient par une cécité nocturne et un rétrécissement du champ visuel évoluant vers la cécité. La RP peut être associée à une surdité dans le syndrome de USCHER (SU). Des mutations dans un seul gène sont entièrement responsables de la pathologie chez la personne atteinte, mais tous les atteints ne sont pas mutés dans le même gène : la RP et le SU sont des maladies monogéniques. On parle d'hétérogénéité génétique pour indiquer que différents patients présentant la même pathologie peuvent être déficients pour des gènes différents.
Actuellement, 37 gènes responsables de RP ont été dénombrés (31 identifiés et 6 simplement localisés). On en compte 11 pour le SU. Cependant, le gène muté reste inconnu pour une proportion variant de un tiers à la moitié des patients, suggérant qu'il reste de nombreux gènes à identifier avant de pouvoir prétendre connaître les causes moléculaires de la RP. Le but de mon projet de recherche est l'identification de nouveaux gènes responsables de RP et SU.

Dans un premier temps, par une technique de comparaison de l'expression des gènes dans différents tissus, nous avons identifié et localisé au niveau chromosomique 7 gènes potentiellement candidats pour le SU et recherché des mutations dans l'un d'entre eux. Des études fonctionnelles de ce dernier ont également été menées au laboratoire. Pour une deuxième approche synergique à la première, 7 grandes familles atteintes de RP ont été rassemblées, afin d'identifier le gène muté à partir de sa localisation chromosomique précise. Pour 6 familles qui n'étaient pas mutées pour un des 37 gènes connus ou localisés, nous avons comparé la transmission de la maladie dans la famille avec 388 marqueurs, répartis sur l'ensemble des chromosomes, afin d'identifier un marqueur, qui systématiquement transmis avec la pathologie chez les descendants, sera considéré comme voisin sur le chromosome du gène muté.
Dans le cas d'un marqueur situé sur le chromosome juste à côté de la mutation recherchée, la même forme du marqueur (allèle) et la mutation vont être transmis ensemble chez toutes les personnes atteintes de la famille et seulement chez elles. Repérer un tel marqueur parmi les 388 testés équivaut à localiser précisément le gène muté dans la famille.
Pour 2 familles présentant une transmission récessive, une petite portion de chromosome où se situe le gène muté a ainsi pu être identifiée. Cette recherche est bien avancée pour une troisième famille dominante. La comparaison de ces localisations chromosomiques avec les banques de données bio-informatiques (séquence du génome humain entièrement disponible, banque d'expression) a permis de sélectionner plusieurs gènes candidats que nous sommes maintenant en train de séquencer à la recherche de mutation.
Une fois le gène identifié, la recherche de mutations (D-HPLC) sera bien sûr étendue à l'ensemble des 750 familles de patients de la banque de Montpellier (2061 prélèvements). Par la suite, des études du rôle de cette protéine dans la rétine seront envisagées pour mieux comprendre comment son déficit altère la vue. Cette connaissance devra permettre d'imaginer des pistes thérapeutiques adaptées.
Enfin, pour la septième famille, le gène en cause se situe dans une région chromosomique où un gène responsable de RP a déjà été localisé sans être identifié. La richesse en consanguinité et la grande taille de notre famille nous ont permis de réduire la localisation du gène muté à une très petite région (250 kbp).
Nous avons identifié dans cet intervalle deux gènes exprimés fortement dans la rétine. Il est intéressant de noter que le premier gène a été identifié en janvier 2004 et le deuxième n'était pas caractérisé. La structure de ce tout nouveau gène a été définie au laboratoire, à partir de rétine humaine. La recherche de mutations est en cours.

Remarquons pour conclure que la fréquence de mutation de ce gène a été estimée à environ 10 à 20 % des patients, ce qui laisse supposer que son identification pourrait intéresser un nombre non négligeable de personnes atteintes.

* Monsieur Thomas GUIGNARD : " Recherche de nouveaux gènes de l'épithélium pigmentaire de la rétine (EPR) impliqués dans les Rétinites Pigmentaires "

Au fond de l'œil se trouve un tissu, la rétine, qui est composé de plusieurs couches cellulaires. Parmi ces types de cellules, notons les photorécepteurs (comprenant bâtonnets et cônes) qui captent la lumière et la traduisent en signal nerveux et une simple couche de cellules appelée épithélium pigmentaire (EPR) qui contrôle l'homéostasie et la viabilité des photorécepteurs et participe au Cycle Visuel.
Dans les segments externes des bâtonnets photorécepteurs, la rhodopsine peut capter la lumière grâce à une molécule-pigment (un chromophore), le 11-CIS Rétinal, dérivé de la Vitamine A d'origine alimentaire. La capture de la lumière induit une modification de la forme "active" 11-CIS Rétinal en forme TRANS Rétinal "inactive", ce qui déclenche le phénomène de la Vision. Toutefois, pour que la Vision soit continue, il est indispensable de reformer continuellement le chromophore sous forme de 11-CIS Rétinal, seul capable de capter la lumière.
La reformation du 11-CIS Rétinal se produit dans l'EPR via de nombreuses modifications biochimiques. Ces étapes sont axées autour d'une protéine indispensable, RPE65 (identifiée en 1993 par Christian HAMEL) capable de régénérer la forme 11-CIS. L'expression "Cycle Visuel" désigne la régénération métabolique du chromophore. Ce Cycle constitue un mécanisme fondamental de la perception visuelle. Lorsque le Cycle est stoppé, le déficit de nouvelles molécules actives empêche la vision et provoque à plus ou moins long terme une dégradation des cellules de la rétine.
Sur un plan clinique, chaque protéine impliquée dans ce Cycle Visuel, lorsqu'elle est mutée, conduit à des Rétinites pigmentaires consécutives à une dégénérescence des photorécepteurs et de l'EPR. Ces formes de cécité touchent 1 personne sur 4000. En particulier, les mutations de RPE65 provoquent environ 300 cas de cécité grave chez l'enfant en France, ce qui souligne le rôle particulier de cette protéine.
Il faut noter que tous les gènes du cycle visuel responsables de rétinopathies ne sont pas connus à l'heure actuelle. Or l'identification préliminaire de ces intervenants est essentielle pour la mise en place de thérapies substitutives.
En effet, si la protéine RPE65 peut reformer à nouveau du 11-CIS Rétinal, il est maintenant bien établi qu'elle a besoin d'autres protéines, de partenaires moléculaires, pour agir. Ainsi, si RPE65 entraîne des cécités sévères, il est inévitable que ses partenaires en génèrent également, d'où l'intérêt de trouver ceux-ci.

Afin d'identifier les partenaires de RPE65 une technique dite de "double hybride" chez la levure a été initiée au laboratoire en utilisant la forme entière de RPE65. Cette technique comparable à la pêche à la ligne permet d'isoler de nouvelles protéines attirées par RPE65. Ainsi, une "banque" de protéines porcines a été criblée, les avantages de cette approche étant la facilité d'obtention du matériel biologique (abattoirs de Nîmes) et la forte ressemblance sur un plan moléculaire entre l'Homme et le porc (~95%).

Sur 3 millions de protéines testées, 17 candidates ont été retenues. Selon des critères de similarité fonctionnelle à RPE65, certaines présentent un intérêt fort et un potentiel encourageant, notamment en participant au métabolisme de la Vitamine A, en transportant des acides gras à travers les membranes cellulaires ou en s'attachant à celles-ci. Il a également été retenu des protéines de fonctions inconnues ouvrant la porte à de nouvelles découvertes.
Nous avons retrouvé la trace de ces protéines candidates dans des extraits de rétine, mais également dans d'autres tissus.

Ces données préliminaires nous incitent à poursuivre les investigations en confirmant les interactions entre RPE65 et les protéines entières candidates par GST pulldown et en co-localisant les partenaires en immuno cyto et histochimie.

Par ailleurs en collaboration avec une équipe INRA de Dijon, la mise au point d'une méthode de mesure d'activité enzymatique de type isomérase est en cours pour tester les partenaires obtenus, transfectés dans une lignée de cellules d'EPR (ARPE19).

De même, une autre collaboration interne à l'Institut de Neurosciences de Montpellier ( INM) vise à établir comment les partenaires participent à la dynamique membranaire du chromophore dans l'EPR, ce qui représente un aspect fonctionnel fondamental du Cycle Visuel.
Enfin, à moyen terme des mutations des partenaires seront recherchées dans la banque de patients, dont nous disposons au CHU afin d'évaluer le niveau pathogène de chaque candidat.

A terme, la connaissance actuelle des mécanismes de régénération du 11-CIS Rétinal permettront de cibler au mieux les thérapies de demain.

* Mademoiselle Murielle CHEN KUO CHANG : " Tout voir et savoir sur OPA1 dans les cellules ganglionnaires de la rétine "

L'Atrophie optique dominante (AOD) ou maladie de Kjer est une rétinopathie à transmission dominante entraînant une mal voyance, voire une cécité. Sur le plan clinique, elle se caractérise par un scotome centro-caecal, une dyschromatopsie dans l'axe bleu-jaune, et une atrophie du nerf optique responsable de la baisse de l'acuité visuelle. Sur le plan histologique, elle se caractérise par une dégénérescence très spécifique des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR), une perte de leur myéline et par conséquent une atrophie du nerf optique.

L'objectif de mon travail est, à moyen terme, de contribuer à développer une stratégie de protection et de thérapie des atrophies optiques.

Nous avons choisi de baser notre étude sur l'Atrophie Optique Dominante de type I dont le gène incriminé (OPA1) a été identifié au laboratoire. (OPA1 code pour une GTPase exprimée ubiquitairement, appartenant à la famille des dynamines et localisée dans la mitochondrie).
Les différents types de mutation pathogène d'OPA1 suggèrent que l'héritabilité de la maladie peut adopter un caractère de dominance négative ou d'haplo-insuffisance.
L'objectif de mon travail consiste à caractériser les paramètres cellulaires et moléculaires des CGR, qui les rendent particulièrement sensibles aux dysfonctions d'OPA1.

Pour analyser les voies entraînant cette dégénérescence, nous avons choisi d'utiliser des techniques d'exploration des CGRs basées sur la transfection de RNA interférents spécifiques d'OPA1 (siRNA-OPA1), capables de bloquer l'expression des protéines OPA1. Notre stratégie consiste à utiliser l'extinction d'OPA1 sur un modèle de culture des CGR in vitro, qui permet d'étudier leurs spécificités cellulaires et un modèle in vivo, qui permet d'appréhender leurs spécificités tissulaires et fonctionnelles.
Les résultats que nous avons obtenus depuis un an, montrent que in-vitro l'absence d'OPA1 induit une déstructuration du réseau mitochondrial (marquage mitotracker), la perte du potentiel de membrane (marquage au JC1), et une induction d'apoptose (méthode tunnel). Afin de préciser le degré de susceptibilité des CGRs au mécanisme apoptotique, nous sommes en train de comparer le comportement de ces cellules avec des cellules granulaires du cervelet.
Dans le modèle in-vivo, nous injectons du siRNA-OPA1 intraoculaire chez des souris âgées de 11 jours. Nos résultats montrent que sur le plan histologique, il y a une perte sélective des CGRs de 40% au bout de 2 jours et d'environ 60% au bout de 2 mois. Sur le plan fonctionnel, l'électrorétinogramme, reflet du fonctionnement de la rétine est normal chez les souris traitées. En revanche, la mesure du potentiel évoqué visuel, traduisant une transmission correcte de l'intégrité des voies optiques, est nul chez les animaux traités au siRNA-OPA1 après 2 mois de traitement. Cette observation peut-être corrélée avec la perte des CGRs.

La mise au point de ces deux techniques permettra d'étudier in-vitro la fonctionnalité et les particularités des mitochondries des CGRs, en parallèle à un autre type de neurone, en absence ou présence d'allèles d'OPA1 mutés ou non. Le modèle développé in-vivo nécessite de nouvelles expérimentations pour confirmer et préciser les effets observés jusqu'à présent. Ces approches conjointes permettront de préciser l'effet patho-physiologique induit par les mutations d'OPA1 et d'envisager des stratégies préventives ou thérapeutiques des Atrophies Optiques.